《新世纪福音战士新剧场版：序》讲述了14岁少年碇真嗣被父亲碇源堂召唤到第3新东京市的故事。本以为能见到父亲的他，却目睹了名为“使徒”的巨大生物与军队交战。危急时刻，特务机关NERV的葛城美里救下真嗣，并带他前往NERV总部。然而，迎接真嗣的是父亲冷酷的命令：驾驶名为“EVA”的巨大人型机器人与使徒战斗。真嗣起初拒绝，但看到重伤的替补驾驶员绫波丽后，决定接受任务。从未受过训练的真嗣，准备驾驶EVA初号机迎战使徒。与此同时，身份不明的绫波丽和来自德国的驾驶员惣流·明日香·兰格雷也加入战斗。在使徒不断来袭的过程中，碇源渡暗中观察一切，推动着名为“人类补完计划”的神秘计划。