《圣母在上第二季》延续莉莉安女子学院优雅精致的校园生活，聚焦福泽佑巳与小笠原祥子这对"姐妹"的情感发展。新学期伊始，佑巳正式成为祥子的"妹妹"，却因不熟悉贵族礼仪频频闹出笑话。随着红蔷薇花蕾岛津由乃与支仓令的加入，山百合会迎来新成员。当祥子突然疏远佑巳时，黄蔷薇家族的二条乃梨子道破关键："真正的姐妹不是靠玫瑰念珠维系，而是心意相通"。与此同时，白蔷薇家族的佐藤圣与久保栞的往事逐渐浮出水面，揭示出莉莉安代代相传的"姐妹制度"背后更深层的羁绊。在圣诞夜的山百合会派对中，佑巳终于冲破心结，与祥子共同谱写出属于她们的圣母颂歌。