渐渐适应现代生活的美国队长史蒂夫·罗杰斯在执行任务时察觉到神盾局内部暗藏危机。当他发现神盾局秘密推进的"洞察计划"后深感不安。某日，局长尼克·弗瑞遭遇袭击，临危将存有重要机密的U盘交给罗杰斯。随后美国队长被诬陷杀害尼克，遭到神盾局追捕。他与黑寡妇娜塔莎·罗曼诺夫联手调查，发现潜伏多年的九头蛇组织已渗透神盾局高层。在逃亡过程中，他们结识了退伍军人猎鹰山姆·威尔逊。面对昔日好友巴基·巴恩斯被洗脑成为冬日战士的残酷事实，美国队长必须阻止九头蛇利用空中母舰屠杀数百万人的阴谋，同时唤醒巴基的记忆。最终他们成功摧毁母舰，揭露了神盾局内部的叛徒，但九头蛇的威胁仍未彻底消除。