《美国队长2》讲述了史蒂夫·罗杰斯逐渐适应现代生活后，发现神盾局内部隐藏着巨大危机。在执行一次任务时，他察觉到“洞察计划”背后的阴谋，并为此感到愤怒。某天，神盾局指挥官尼克·弗瑞遭到袭击，临危之际将一支U盘交给美国队长，里面藏着二战以来最重要的秘密。随着调查深入，史蒂夫发现神盾局已被九头蛇渗透，他与黑寡妇娜塔莎·罗曼诺夫和猎鹰山姆·威尔逊联手，揭露真相并阻止“洞察计划”的实施。与此同时，他还面对了昔日好友巴基·巴恩斯，现已成为被洗脑的冬日战士。最终，美国队长成功阻止了阴谋，但也付出了惨重代价，神盾局也因此解体。